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Muestras Purificadas

Contacto o Información”secuencia@cnio.es

Inserto clonado

  • Para vectores de bajo número de copia se requieren sistemas de purificación midi- o maxi-prep. El método de preparación más recomendable es el basado en lisis alcalina con purificación por intercambio iónico (p.ej rango ultrapuro de Qiagen).
  • Para vectores de alto número de copias (plásmidos) se pueden obtener buenos resultados con lisis alcalina y purificación por adsorción a sílice (p.ej High purity de Qiagen). Una diálisis frente a agua o una precipitación final con PEG o alcohol puede ser beneficiosa.
  • Es importante asegurar la ausencia de impurezas inorgánicas (no detectables por espectrofotometría UV) ya que interfieren tanto en la reacción de secuenciación como durante el análisis.
  • Las muestras se requieren en disolución (no desecadas) y ajustadas a la concentración adecuada (véase tabla más abajo, en “Cantidad de muestra purificada”).

Producto de PCR

  • El molde a secuenciar ha de ser homogéneo. Si la PCR produce fragmentos inespecíficos, sus productos han de fraccionarse por electroforesis y el fragmento específico purificado (es importante limitar su exposición a la luz UV).
  • Si la PCR sólo produce el fragmento específico no se necesita purificarlo por electroforesis. Sin embargo, antes de enviarlo al servicio de secuenciación es necesario eliminar dNTPs e iniciadores residuales, y ajustarlo a la concentración requerida (véase tabla de cantidades más abajo).
  • Entre los métodos que pueden producir resultados satisfactorios en la eliminación de residuos están la adsorción a sílice (Qiaquick, Qiagen), la ultrafiltración (Microcon, Millipore) y el tratamiento enzimático (ExoSAP de GE Healthcare, o SeqDirect de Qbiogene).
  • Se requiere una alícuota del iniciador de secuenciación según las condiciones citadas en el apartado siguiente.

Cantidad de muestra purificada

  • Se requiere un mínimo de 15 µl de DNA molde disuelto en agua ultrapura o en una disolución 0,1 mM de EDTA pH8 y ajustado a la concentración que figura en la tabla.
  • Adjuntar 2 µl adicionales para cada reacción adicional a la primera (p.ej. para tres reacciones, adjuntar un volumen mínimo de 15+2+2= 19 µl).

Estos requerimientos se refieren a concentraciones medidas por espectrofotometría (p.ej. Nanodrop). La espectrofotometría se asocia con valores sobreestimados, particularmente para bajas concentraciones (inferiores a 10ng/µL). Reducir estos valores a la mitad para disoluciones ultrapuras de ADN o para mediciones más exactas, como las realizadas por fluorometría (Qubit de Invitrogen o Quantus de Promega) o por valoración de análisis electroforético en presencia de un marcador de cuantificación (“mass DNA ladder” de NEB o ThermoFisher.)

Iniciadores de Secuenciación

  • El Servicio proveerá sin cargo los iniciadores universales tales como M13Rv, M13Fw, T7, SP6 y T3. Se puede consultar la secuencia y disponibilidad de otros menos frecuentes en el documento iniciadores.xls (32 KB).
  • Remitir los iniciadores específicos de gen en un volumen de 15 µl y ajustados a una concentración de 3 pmol/µl (3 µM) en agua ultrapura o en una disolución de EDTA pH8 0,1 mM, en tubos independientes y convenientemente rotulados. Acompañar 2 µl (6 pmol) adicionales por cada molde adicional que precise el mismo iniciador.

Diseño de iniciadores

  • Sitio de unión al menos 50 bases anterior a la secuencia que se pretende obtener.
  • Tm superior a 55º y calculada con la fórmula:
  • Tm= 73 +0,41(% G+C) -675/L
  • (donde “% G+C” es el contenido (%) del oligo en Gs y Cs, y “L” sulongitud)
  • Longitud a partir de 17-mer (en función de su Tm)
  • Evitar trechos homopoliméricos de más de cuatro bases, especialmente al extremo 3′.

Entrega de Resultados

El plazo de entrega habitual es de dos días hábiles desde la fecha de recepción (muestras recibidas en el Servicio antes de las 10 h, un día más para las recibidas con posterioridad a esa hora).

Los resultados se hacen disponibles en forma de archivo comprimido depositado en un servidor Ftp. El usuario recibe por correo-e un enlace privado (combinación aleatoria) que le permite acceder a dicho archivo.

Formato del resultado

Una vez descomprimido el archivo de resultados (mediante aplicaciones del tipo WinZip, FilZip, Stuffit Expander) se obtiene un archivo individual por cada electroforegrama en formato *.ab1. Los archivos en formato “ab1” se pueden abrir con numerosos paquetes comerciales de análisis de secuencias, así como con programas gratuitos como los siguientes:

FinchTV
4Peaks (URL error)
Chromas

Ordenadores Mac

El control de los secuenciadores actuales se realiza desde entornos Windows. Si su ordenador es un Mac con sistema operativo Mac OS X podrá abrir archivos de secuencia en formato PC original sin dificultad. Los visores de electroforegramas gratuitos para Mac OS X como 4Peaks o FinchTV son capaces de interpretar cualquier formato.

Si su sistema operativo es anterior al Mac OS X y no puede abrir los resultados en formato PC precisará realizar el siguiente paso de conversión.

Instrucciones para reformatear electroforegramas Windows a Mac (unicamente necesario para visores en Mac OS 9 o que no interpreten formato de archivos *.ab1)

1.- Descargar el programa “ conversion script”: Descomprimirlo (mediante una aplicación del tipo Stuffit Expander). En este momento se crea una carpeta con varios elementos: un archivo ‘readme’ y una aplicacion llamada “WinToMac”. La función de esta aplicación es adaptar los archivos en formato Win al Mac. Sólo necesitará realizar esta instalación la primera vez.

2.- Descargar el archivo comprimido conteniendo resultados de secuenciacion en formato Windows, a partir del enlace enviado por nuestro servicio a traves del correo-e (véase más arriba).

3.- Descomprimir el archivo comprimido en una carpeta nueva del Mac de destino (Stuffit Expander). En esa carpeta aparecera 1 archivo nuevo por cada electroforegrama, todavia en formato Windows. Es importante que los archivos a convertir esten en una carpeta, porque el programa no reconoce archivos individuales.

4.- Abrir la aplicacion “WinToMac”. Pulsar el botón “Execute”.

5.- Buscar desde “WinToMac” la carpeta que contenga los electroforegramas descomprimidos en el paso 3. “WinToMac” trabaja seleccionando una carpeta que contiene electroforegramas en su interior, el programa no reconoce archivos individuales. Seleccionar la carpeta con el ratón.

6.- Pulsar el boton “Choose” o “Seleccionar”. En este momento comienza la conversión de formato. Cuando el puntero del ratón vuelva a su aspecto normal (cambiará de una rueda girando a la flecha habitual), sus datos ya se habrán convertido.

Información Adicional

Secuencias fallidas

  • Los procedimientos empleados se han diseñado para minimizar la variabilidad y la frecuencia de secuencias fallidas.
  • No obstante pueden darse fallos debidos a las causas siguientes: a) características de las muestras (molde y/o iniciadores), b) información insuficiente por parte del usuario, y c) error operativo (funcionamiento interno del servicio).
  • Las secuencias fallidas se facturan cuando se estima que las causas sean de los tipos a o b anteriores. Las del tipo c se repiten (véase ” Repeticiones” más abajo).

Causas de error

Las causas de error más habituales que se asocian al material de partida son las siguientes:

  • La cepa bacteriana donde se propaga el molde –en vector de clonación- puede afectar a su calidad. Se obtienen resultados fiables con DH1, DH5alpha, DH10B o XL1-blue; MV1190 y HB101 se asocian con resultados variables, y JM101 no es recomendable.
  • Cantidad insuficiente de DNA molde. Las cuantificaciones por electroforesis de muestras sobrecargadas no son precisas. Una cuantificación fiable requiere limitar la carga de DNA a 10-50 ng/pocillo, para lo que puede ser necesario emplear diluciones, y comparación con marcadores de masa conocida separados en el mismo gel.
  • Calidad o purificación insuficiente del molde. Aunque para su preparación se hayan usado kits comerciales pueden permanecer impurezas que interfieran con la secuenciación.
  • Para productos de PCR las impurezas más habituales son los fragmentos artefactuales (ej. primer dimers) que copurifican con el molde y que contienen sitios de unión para los iniciadores de secuenciación.
  • Problemas diversos con el iniciador específico de inserto: la muestra contiene distintos sitios de unión, no se une al molde, cantidad insuficiente (verificar concentración de la disolución de trabajo por espectrofotometría), diseño subóptimo. Es importante que el valor de Tm haya sido calculado con la fórmula descrita en “Iniciadores de secuenciación”.

Repeticiones

  • Las muestras fallidas se repetirán por propia iniciativa sólo cuando se considere probable que se trate de un error operativo. Si la repetición vuelve a fallar se asumirá que no se debía a errores operativos.
  • Las reacciones fallidas no se repetirán y serán facturadas al precio normal cuando se considere que el fallo pueda deberse al material proporcionado por el usuario o a una información insuficiente.
  • Las muestras fallidas también se podrán repetir a demanda del usuario.

Comunicación de anomalías

Se invita a que los usuarios comuniquen cualquier observación sobre anomalías o incidencias (datos de contacto en la Página Principal).

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