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Muestras Purificadas

Inserto clonado

  • Para vectores de bajo número de copia se requieren sistemas de purificación midi- o maxi-prep. El método de preparación más recomendable es el basado en lisis alcalina con purificación por intercambio iónico (p.ej rango ultrapuro de Qiagen).
  • Para vectores de alto número de copias (plásmidos) se pueden obtener buenos resultados con lisis alcalina y purificación por adsorción a sílice (p.ej High purity de Qiagen, o similar). Una diálisis frente a agua o una precipitación final con PEG o alcohol puede ser beneficiosa para la eliminación de impurezas residuales.
  • Es importante evitar impurezas inorgánicas (no detectables por espectrofotometría UV) ya que interfieren tanto en la reacción de secuenciación como durante el análisis.
  • Las muestras se requieren en disolución (no desecadas) y ajustadas a la concentración adecuada (véase tabla más abajo, en “Cantidad de muestra purificada”).

Producto de PCR

  • El molde a secuenciar ha de ser homogéneo. Si la PCR produce fragmentos inespecíficos, sus productos han de fraccionarse por electroforesis y el fragmento específico purificado (es importante limitar su exposición a la luz UV).
  • Si la PCR sólo produce el fragmento específico no se necesita purificarlo por electroforesis. Sin embargo, antes de enviarlo al servicio de secuenciación es necesario eliminar dNTPs e iniciadores residuales, y ajustarlo a la concentración requerida (véase tabla de cantidades más abajo).
  • Entre los métodos que pueden producir resultados satisfactorios en la eliminación de residuos están la adsorción a sílice (Qiaquick, Qiagen), la ultrafiltración (Microcon, Millipore) y el tratamiento enzimático (ExoSAP de GE Healthcare, o SeqDirect de Qbiogene).
  • Se requiere también una alícuota del iniciador de secuenciación según las condiciones citadas en el apartado siguiente.

Cantidad de muestra purificada

  • Se requiere un mínimo de 10 µl de DNA molde disuelto en 0,1 mM de EDTA pH8 y ajustado a la concentración que figura en la tabla.
  • Adjuntar 2 µl adicionales para cada reacción adicional a la primera (p.ej. para tres reacciones, adjuntar un volumen mínimo de 10+2+2= 14 µl).
Molde purificadoConcentración
Producto de PCR
100-200 pb 3 ng/µL
300-600 pb 6-12 ng/µL
700-1500 pb 14-30 ng/µL
> 1500 pb 40-100 ng/µL
Plásmido 200 ng/µL
BAC, cósmido 500-1000 ng/µL

Estos requerimientos se refieren a concentraciones medidas por espectrofotometría (p.ej. Nanodrop). La espectrofotometría se asocia con valores sobreestimados, particularmente para bajas concentraciones (inferiores a 10ng/µL). Reducir estos valores a la mitad para disoluciones ultrapuras de ADN o para mediciones más exactas, como las realizadas por fluorometría (Qubit de Invitrogen o Quantus de Promega) o por valoración de análisis electroforético en presencia de un marcador de cuantificación («mass DNA ladder» de NEB o ThermoFisher.)

Iniciadores de Secuenciación

  • El Servicio proveerá sin cargo los iniciadores universales tales como M13Rv, M13Fw, T7, SP6 y T3. Se puede consultar la secuencia y disponibilidad de otros menos frecuentes en el documento iniciadores.xls .
  • Remitir los iniciadores específicos de gen en un volumen de 10 µl y ajustados a una concentración de 3 pmol/µl (3 µM) en agua ultrapura o en una disolución de EDTA pH8 0,1 mM, en tubos independientes y convenientemente rotulados. Acompañar 2 µl (6 pmol) adicionales por cada molde adicional que precise el mismo iniciador.
  • Los oligonucleótidos que vayan a usarse como iniciadores de secuenciación no pueden estar conjugados a fluoróforos, ni modificados del cualquier manera que pueda inteferir con el proceso de secuenciación. Consultar en caso de duda.

Diseño de iniciadores

  • Sitio de unión al menos 50 bases anterior a la secuencia que se pretende obtener.
  • Tm superior a 55º y calculada con la fórmula:
  • Tm= 73 +0,41(% G+C) -675/L (donde «% G+C» es el contenido (%) del oligo en Gs y Cs, y «L» su longitud)
  • Longitud a partir de 17-mer (hasta alcanzar la Tm mínima requerida)
  • Evitar trechos homopoliméricos de más de cuatro bases, especialmente al extremo 3′.

Entrega de Resultados

El plazo de entrega habitual es de dos días hábiles desde la fecha de recepción (muestras recibidas en el Servicio antes de las 10 h, un día más para las recibidas con posterioridad a esa hora).

Los resultados se hacen disponibles en forma de archivo comprimido depositado en un servidor Ftp. El usuario recibe por correo-e un enlace privado que le permite acceder a dicho archivo. Más detalles en el apartado Recepción de resultados de la sección Funcionamiento del Servicio.

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