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Muestras Purificadas

Para contacto o información:

Inserto clonado

  • Para vectores de bajo número de copia se requieren sistemas de purificación midi- o maxi-prep. El método de preparación más recomendable es el basado en lisis alcalina con purificación por intercambio iónico (p.ej rango ultrapuro de Qiagen).
  • Para vectores de alto número de copias (plásmidos) se pueden obtener buenos resultados con lisis alcalina y purificación por adsorción a sílice (p.ej High purity de Qiagen). Una diálisis frente a agua o una precipitación final con PEG o alcohol puede ser beneficiosa.
  • Es importante asegurar la ausencia de impurezas inorgánicas (no detectables por espectrofotometría UV) ya que interfieren tanto en la reacción de secuenciación como durante el análisis.
  • Las muestras se requieren en disolución (no desecadas) y ajustadas a la concentración adecuada (véase tabla más abajo, en "Cantidad de muestra purificada").

Producto de PCR

  • El molde a secuenciar ha de ser homogéneo. Si la PCR produce fragmentos inespecíficos, sus productos han de fraccionarse por electroforesis y el fragmento específico purificado (es importante limitar su exposición a la luz UV).
  • Si la PCR sólo produce el fragmento específico no se necesita purificarlo por electroforesis. Sin embargo, antes de enviarlo al servicio de secuenciación es necesario eliminar dNTPs e iniciadores residuales, y ajustarlo a la concentración requerida (véase tabla de cantidades más abajo).
  • Entre los métodos que pueden producir resultados satisfactorios en la eliminación de residuos están la adsorción a sílice (Qiaquick, Qiagen), la ultrafiltración (Microcon, Millipore) y el tratamiento enzimático (ExoSAP de GE Healthcare, o SeqDirect de Qbiogene).
  • Se requiere una alícuota del iniciador de secuenciación según las condiciones citadas en el apartado siguiente.

Cantidad de muestra purificada

  • Se requiere un mínimo de 15 µl de DNA molde disuelto en agua ultrapura o en una disolución 0,1 mM de EDTA pH8 y ajustado a la concentración que figura en la tabla.
  • Adjuntar 2 µl adicionales para cada reacción adicional a la primera (p.ej. para tres reacciones, adjuntar un volumen mínimo de 15+2+2= 19 µl). .
Molde purificado Concentración
Producto de PCR  
100-200 pb 4 ng/µl
300-600 pb 6-12 ng/µl
700-1500 pb 14-30 ng/µl
1500 pb 40-100 ng/µl
Plásmido 200 ng/µl
BAC, cósmido 500-1000 ng/µl