Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas

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Servicios de Apoyo al Sistema Nacional de Salud

Para contacto o información:

Para vectores de bajo número de copia se requieren sistemas de purificación midi- o maxi-prep. El método de preparación más recomendable es el basado en lisis alcalina con purificación por intercambio iónico (p.ej rango ultrapuro de Qiagen).
Para vectores de alto número de copias (plásmidos) se pueden obtener buenos resultados con lisis alcalina y purificación por adsorción a sílice (p.ej High purity de Qiagen). Una diálisis frente a agua o una precipitación final con PEG o alcohol puede ser beneficiosa.
Es importante asegurar la ausencia de impurezas inorgánicas (no detectables por espectrofotometría UV) ya que interfieren tanto en la reacción de secuenciación como durante el análisis.
Las muestras se requieren en disolución (no desecadas) y ajustadas a la concentración adecuada (véase tabla más abajo, en "Cantidad de muestra purificada").

El molde a secuenciar ha de ser homogéneo. Si la PCR produce fragmentos inespecíficos, sus productos han de fraccionarse por electroforesis y el fragmento específico purificado (es importante limitar su exposición a la luz UV).
Si la PCR sólo produce el fragmento específico no se necesita purificarlo por electroforesis. Sin embargo, antes de enviarlo al servicio de secuenciación es necesario eliminar dNTPs e iniciadores residuales, y ajustarlo a la concentración requerida (véase tabla de cantidades más abajo).
Entre los métodos que pueden producir resultados satisfactorios en la eliminación de residuos están la adsorción a sílice (Qiaquick, Qiagen), la ultrafiltración (Microcon, Millipore) y el tratamiento enzimático (ExoSAP de GE Healthcare, o SeqDirect de Qbiogene).
Se requiere una alícuota del iniciador de secuenciación según las condiciones citadas en el apartado siguiente.

Se requiere un mínimo de 15 µl de DNA molde disuelto en agua ultrapura o en una disolución 0,1 mM de EDTA pH8 y ajustado a la concentración que figura en la tabla.
Adjuntar 2 µl adicionales para cada reacción adicional a la primera (p.ej. para tres reacciones, adjuntar un volumen mínimo de 15+2+2= 19 µl). .