Servicios de Apoyo al Sistema Nacional de Salud
Banco de Tumores
Anexo 1: Protocolo
- Traslado del tejido desde los quirófanos hasta el Servicio de AP
- Primer examen de la biopsia o pieza quirúrgica
- Tejido no neoplásico
- Fijación y procesamiento
- Congelación
- Identificación de muestras
- Conservación de tejido fijado
- Conservación de tejido congelado
- Medidas de seguridad para el tejido congelado
- Métodos no estándar
1. Traslado del tejido desde los quirófanos hasta el Servicio de AP
Las piezas quirúrgicas han de ser recogidas en el quirófano inmediatamente tras ser extirpadas, y transportadas sin fijar al Servicio de Anatomía Patológica. Este tránsito ha de llevarse a cabo con la máxima celeridad para minimizar la acción de los fenómenos hipóxicos sobre la expresión génica. Este protocolo se seguirá para cualquier biopsia o pieza quirúrgica cuyo posible diagnóstico implique a cualquier tipo de neoplasia maligna.
El mejor método de traslado de las piezas es sin incluir en ningún tipo de líquido, sino simplemente en un recipiente cerrado y con igual celeridad que si se tratase de una biopsia intraoperatoria.
2. Primer examen de la biopsia o pieza quirúrgica
Será el patólogo quien decidirá si es posible separar uno o más fragmentos para ser congelados sin que esta maniobra afecte al correcto diagnóstico anatomopatológico del proceso.
El material seleccionado para congelación deberá corresponder, en la medida de lo posible, a uno ó dos fragmentos de 1,5 x 1,5 x 0,4 cm. Deberán evitarse aquellas áreas con masivos fenómenos isquémicos y/o necróticos. Por cada fragmento congelado se seleccionará un fragmento de tejido de semejantes dimensiones, en continuidad con el material congelado. Este segundo fragmento será el seleccionado para fijación en formol, informará acerca de la cantidad de tumor presente en el bloque y servirá para estudios inmunohistoquímicos y moleculares adicionales.
Todo este proceso ha de realizarse en las mejores condiciones de asepsia posibles.
3. Tejido no neoplásico
Siempre que sea posible, se seleccionará otro par de fragmentos, tanto para congelación como para fijación e inclusión en parafina, correspondiente a tejido no neoplásico, lo más celular posible.
Algunos estudios precisarán de la captación de mucosa bucal como fuente de tejido en fresco. En estos casos se deberá pasar un cepillo citológico o una torunda por la cara interna de la mejilla, después de haber procedido a enjuagar la cavidad bucal con un líquido antiséptico. Tras la toma, cortar el extremo de la torunda, introducir en un criotubo con agua destilada y dejar bien tapado durante 2-3 horas para que las células se disuelvan en el medio. Tras ese periodo desechar el extremo de torunda y centrifugar el criotubo con el agua destilada y el componente celular durante 10 minutos a 3.000 rpm. Desechar el máximo de agua destilada posible para aislar el pellet celular resultante. Tapar perfectamente el criotubo, congelar por inmersión en nitrógeno líquido o isopentano y almacenar como si fuese una muestra tisular convencional.
4. Fijación y procesamiento
El tejido, tanto normal como neoplásico, seleccionado para fijación e inclusión en parafina se distribuirá en fragmentos no superiores a 1,5 x 1 x 0,5 cm. Y se fijarán en formol tamponado al 10% durante un mínimo de 16 y un máximo de 48 horas, tras lo cual se incluirá en parafina según técnicas convencionales. Estos fragmentos especialmente seleccionados se incluirán en un cassette histológico de color característico, debidamente identificado.
5. Congelación
Las muestras se congelarán debidamente identificadas en criomoldes de plástico (P.ej.: Crymold standard, 25x20x5 mm, Tissue-Tek 4557, Distribuidor Bayer S.A) embebidas en un medio criosolidificable (OCT-Compound, Tissue-Tek 4583, Distribuidor Bayer S.A) mediante inmersión en un medio altamente criogénico que permita la congelación rápida.
El medio ideal para congelación rápida es isopentano enfriado hasta su punto de congelación (-160ºC). Para lograr esto se ha de incluir el recipiente que contiene el isopentano en otro conteniendo nitrógeno líquido. El punto de congelación corresponde aproximadamente con el momento en que comiencen a formarse gotas opacas en el isopentano. El proceso de enfriamiento del isopentano se facilita manteniéndolo dentro de un arcón congelador a -80ºC.
La inmersión directa en isopentano enfriado a –80ºC (mantenido en arcón congelador) o a temperaturas en torno a –50ºC (Histobath®, y similares) son igualmente métodos válidos y de mayor sencillez.
La congelación mediante inmersión directa en nitrógeno líquido es un método válido, si bien es más lesivo para el tejido y dificulta el examen microscópico posterior, especialmente cuando se precise realizar técnicas de microdisección. El nitrógeno líquido se vaporiza al entrar en contacto con el tejido, provocando una congelación irregular. Por el contrario el isopentano permanece en estado líquido evitando estos artefactos, y al ser altamente crioconductor permite una congelación especialmente rápida.
Ha de evitarse de forma absoluta la congelación lenta mediante inserción del tejido en frigorífico, arcón congelador o criostato, ya que dificulta mucho la realización de posteriores cortes de criostato de buena calidad por la formación de cristales de hielo.
6. Identificación de muestras
Cada una de las muestras a procesar para el banco de tejidos será inmediatamente identificada según el protocolo de identificación de muestras, con clara referencia al tipo de tejido (normal o patológico). Esta identificación debe hacerse, siempre que sea posible, de forma mecanizada para una mayor claridad de las referencias.
La identificación final de las muestras se realizará mediante un sistema doble de código de barras y caracteres alfanuméricos mediante la generación de etiquetas identificativas para preparaciones, bloques, informes, etc. Con el fin de asegurar al máximo la correcta identificación de cualquier muestra y evitar errores humanos en la transcripción de referencias, se realizarán siempre estas maniobras de forma mecanizada mediante lector/generador de código de barras.
7. Conservación de tejido fijado
Los bloques de tejido fijado e incluido en parafina previamente seleccionados para su disponibilidad por el CNIO, conteniendo bien tejido neoplásico como no neoplásico, se identificarán convenientemente con el fin de no ser usados para diagnóstico, excepto que esto sea realmente necesario.
Se podrán conservarán en archivadores específicamente dispuestos para este fin hasta que sean requeridos para algún proyecto concreto o bien en los archivadores propios del material diagnóstico del Hospital.
Los tejidos fijados se conservarán en los propios Servicios de Anatomía Patológica de los Hospitales concertados o colaboradores, excepto que algún Centro prefiera que sean mantenidos temporal o definitivamente en los locales del PPM del CNIO.
8. Conservación de tejido congelado
Los bloques de tejido congelado e incluido en criomoldes con OCT, previamente seleccionados para su disponibilidad por el CNIO, conteniendo tanto tejido neoplásico como no neoplásico, se identificarán convenientemente con el fin de no ser usados para diagnóstico, excepto que esto sea realmente necesario.
El tejido se almacenará a temperaturas inferiores a -75 grados centígrados en arcones con las necesarias medidas de seguridad para evitar su descongelación y/o su exposición a grandes diferencias de temperatura.
Los criomoldes debidamente identificados de archivarán en cajas especialmente diseñadas hasta que sean requeridos para algún proyecto concreto.
Los tejidos congelados se conservarán en los propios Servicios de Anatomía Patológica de los Hospitales concertados o colaboradores, excepto que algún Centro prefiera que sean mantenidos temporal o definitivamente en los locales del PPM del CNIO.
9. Medidas de seguridad para el tejido congelado
El mantenimiento del tejido congelado en arcones frigoríficos de –80ºC presentan numerosas ventajas respecto a la conservación en contenedores de Nitrógeno líquido como son su mejor accesibilidad, mayor facilidad de instalación y menor necesidad de mantenimiento. Por su parte el nitrógeno líquido asegura una temperatura menor y más estable. Sin embargo la principal ventaja del almacenaje a –80ºC se refiere a la utilización posterior del tejido para estudios la patología donde es necesario realizar cortes en congelación y mantener una correcta calidad de conservación de la morfología tisular.
Los arcones frigoríficos, al depender de la red eléctrica, precisan de unas correctas medidas de seguridad que minimicen el riesgo de grandes alteraciones en la temperatura interior.
Estas medidas de seguridad se resumen en las siguientes:
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Inserción en la red de seguridad del Hospital de forma que, en caso de déficit en el aporte eléctrico, pase a depender de los generadores de emergencia.
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Triple sistema de alarma. Cualquier aumento de temperatura por encima de un 10% de los -80ºC debe disparar una progresiva sucesión de alarmas:
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Alarma local (acústica y visual), en la sala donde está dispuesto el arcón y en alguna dependencia próxima.
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Alarma a distancia. Si pasado 15 minutos no se ha actuado sobre el sistema de alarmas se activa un estímulo acústico y visual en alguna dependencia situada a distancia, en el mismo edificio o complejo (Mantenimiento, seguridad, etc.) donde deba haber presencia de personal durante las 24 horas al día. Esta alarma no tendrá efectividad si no se dejan escritas unas indicaciones (claras y concisas) de lo que se debe hacer.
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Alarma remota. Si pasados otros 15 minutos no se ha actuado sobre el sistema de alarmas se activará un sistema de localización telefónica a una serie de números previamente programados.
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Previsión de contingencias y más concretamente localización de otros arcones de similares dimensiones y características donde poder trasladar el tejido en caso de avería o limpieza del equipo principal. Estos arcones deberían localizarse en locales del mismo Hospital o Complejo pertenecientes a otros Servicios o Unidades clínicas o docentes de la misma institución.
En previsión de la falta de disponibilidad de depósitos alternativos, el CNIO mantendrá un espacio de reserva en forma de arcones congeladores de –80ºC para contingencias imprevisibles. Control de temperatura mediante gráfica semanal.
10. Métodos no estándar
Los métodos anteriormente descritos han de considerarse como el estándar para la captación permanente y sistemática de casos. Cuando para la realización de un proyecto concreto se precise otros métodos de selección, fijación o almacenamiento, la oficina central de RBT elaborará junto con el grupo titular del proyecto un protocolo específico adecuados a los fines de la investigación. Estos protocolos serán distribuidos entre los hospitales asociados para la correcta manipulación de estos casos, previo informe favorable, en caso de ser necesario, de las Comisión de Seguimiento y de Investigación de cada Hospital. Una vez recolectado el número idóneo de casos previamente fijado cesaría la participación de la red de RBT en dicho proyecto.
